پروژه و تحقیق بررسی مولکولی اینتگرون ها در بین ایزوله های اشریشیا کلی جدا شده از عفونت ادراری

توضیحات:

پایان نامه دوره کارشناسی ارشد بررسی مولکولی اینتگرون ها در بین ایزوله های اشریشیا کلی جدا شده از عفونت ادراری 

نکته: این پایان نامه فقط در وبسایت فایل اکی و بصورت انحصاری به فروش می رسد.

قسمتی از متن:

مقدمه و هدف:

اشریشیا کلی عامل اصلی عفونت دستگاه ادراری است . اینتگرون ها از عوامل ژنتیکی متحرکی هستند که باعث گسترش و حمل ژن های مقاومت آنتی بیوتیکی در بین باکتری ها م ی گردند. هدف از انجام این مطالعه تعیین الگوی مقاومت آنتی بیوتیکی، بررسی شیوع اینتگرون های کلاس یک، دو و سه وتعیین ارتباط آن در ایجاد مقاومت نسبت به آنتی بیوتیک ها در ایزوله های اشریشیا کلی جدا شده از عفونت های ادراری می باشد.

مواد و روش تحقیق: صد و بیست نمونه اشریشیا کلی از مهر 93 تا خرداد ماه سال 94 از بیمارستان های شهدا عشایر و مدنی شناسایی شدند. حساسیت ایزوله ها به آنتی بیوتیک ها به روش دیسک آگار دیفیوژن تعیین شد. سپس ایزوله های مقاوم به حداقل یکی از این آنتی بیوتیک ها جهت بررسی مولکولی انتخاب شدند.

یا فته ها : بیش ترین مقاومت آنتی بیوتیکی در ایزوله های اشریشیا کلی  نالیدیکسیک اسید (89.1%) ، آمپی سیلین (87.5%)، سفوتاکسیم(78%)، سفتازیدیم(78%)، تتراسایکلین (76%)، سیپروفلوکساسین(48%) بود . فراوانی اینتگرون کلاس یک در بین ایزوله ها 5/63% و فراوانی کلاس دو 9/14% بدست آمد.کلاس 3 یافت نشد.

نتیجه گیری:

میزان شیوع اینتگرون کلاس یک درایزوله های اشریشیاکلی مورد مطالعه بسیار بالا می باشد، که این عامل احتمالاً می تواند نقشی در تسهیل گسترش سویه هایی با مقاومت چند دارویی داشته باشد.

مقدمه:

عفونت های ادراری از جمله عفونت شایع در جوامع مختلف می باشند میزان شیوع این عفونت در افراد مسن و خانم های جوان بیشتر است . عامل بسیار مهم و اصلی این عفونت ها با کتری اشریشیای کلای از خانواده انترو باکتر یا سه است که عامل بیش از 70  درصد این عفونت ها ست .  در درمان این عفونت های باکتریایی از آنتی بیوتیک های مختلف استفاده می شود . متاسفانه استفاده بیش از حد از این داروها منجر به پیدایش مقاومت در بین این عوامل عفونی شده است. تا سالهای اخیر تصور می شد که انتقال مقاومت به آنتی بیوتیکها در باکتری ها عمدتا به طریق کونژوگاسیون و ترانسداکشن توسط پلاسمیدها، فاژها وترانسپوزونهای حمل کننده ژنهای مقاومت صورت می گیرد. اما در سال 1995Hall وCollis مکانیسم دیگری از انتقال ژن مقاومت به انتی بیوتیک راشناسایی کردند که توسط عناصری به نام اینتگرون انجام می شود .نقش اینتگرون ها به عنوان عناصر ژنتیکی متحرک در انتقال افقی مقاومت آنتی بیوتیکی مشخص شده است. اینتگرون ها عناصری هستند که می توانند در پلاسمیدها، کروموزوم ها و یا ترانسپوزون ها جای گیرند. این عناصر از جمله فاکتورهای دخیل در توسعه مقاومت های چند گانه بوده و همانند پلاسمید ها و ترانسپوزن ها جز مولفه های ژنتیکی متحرک در کسب و انتشار عوامل مقاومت می باشند.  5 کلاس مختلف از اینتگرون ها شناسایی شده اند که اینتگرون های کلاس I به طور متداول در ایزوله های بالینی باسیل های گرم منفی از جمله اشریشیا کلی یافت و منجر به انتشار مقاومت چند گانه آنتی بیوتیکی و مشکلات جدی درمانی در سراسر جهان گردیده است.  یک ارتباط قوی بین حمل اینتگرون و افزایش مقاومت به تعدادی از کلاس های مختلف آنتی بیوتیکی وجود دارد. با توجه به اینکه ژن های مقاومت بروی اینتگرون ها قرار دارند که می توانند از یک سویه به سویه دیگر منتقل شوند و مقاومت را در بیمارستان یا دیگر محیط های درمانی منتشر نمایند لذا این امر اهمیت شناسایی این نوع از ژن های مقاوت آنتی بیوتیکی را دو چندان کرده و تعیین شیوع این ژن ها جهت اجرای برنامه های کنترل عفونت و همچنین مقاومت آنتی بیوتیکی و ممانعت از انتشار عفونت های ناشی از این ارگانیسم را ضروری می نماید.

فهرست مطالب:

چکیده

مقدمه

1-1 انتروباکتریاسه

1-1-1 طبقه بندی

1-1-2مورفولوژی وساختمان

1-2 - اشریشیا کلی

1-2-1- طبقه بندی

1-2-3-  شکل باکتری

1-2-4-  اختصاصات کشتی و بیوشیمیایی

1-3- ساختمان آنتی ژنی اشریشیا کلی

1-3-1-آنتی ژن های سوماتیک یا آنتی ژنO

1-3-2-  آنتی ژن کپسولی یا آنتی ژن K

1-3-3- آنتی ژن H یا پیلی

1-4- .توکسین های اشریشیا کلی

1-4-1 انتروتوکسین ( اگزوتوکسین

1-4-2 وروتوکسین ( توکسین شبه شیگا

 1-5-  عفونت های اشریشیا کلی

 1-6- انواع اشریشیا کلی

11-6-1 اشریشیا انتروپاتوژن

1-6-2- اشریشیا انتروتوکسیژن

1-6-3-اشریشیاکلای مهاجم

1-6-4-  اشریشیا انترواگریگیسیو

1-6-5-اشریشیا انتروهموراژیک

1-6-6- ایشرشیا کلی منتشر شونده روده ای (DAEC

1-6-7 –ایشریشیا کلی اوروپاتوژنز (UPEC

1-7-آنتی بیوتیک ها

1-7-1- طبقه بندی آنتی بیوتیک ها

1-7-2- مکانیسم اثر داروهای ضد میکروبی

1-8- مقاومت در برابر داروهای ضد میکروبی

1-8-1- غیر فعال کردن برخی از داروها

1-8-2- تغییر در نفوذ پذیری داروها

1-8-3- تغییر در ساختار میکروارگانیسم ها

1-8-4- تغییر مسیر متابولیسمی میکروب ها

1-9  اینتگرون ها

 1-9-2 ساختار اینتگرون ها

 1-9-3- انواع اینتگرون ها

1-9-3-1 اینتگرون های کلاس 1

1-9-3-2 - اینتگرون های کلاس II 

1-9-3-3- اینتگرون های کلاس III

1-9-3-4- اینتگرو نهای کلاس IV (سوپراینتگرون ها)

1-10- کاست های ژنی

1-10-1- ساختار کاست های ژنی

1-10-2- بیان کاست های ژنی

2-1-  مواد مورد استفاده 

2-1-1- محیط های کشت 

2-1-2 سایر ترکیبات

2-1-3-وسایل مورد استفاده

2-2- جمع آوری نمونه

2-3- تشخیص آزمایشگاهی

2-3-1-رنگ آمیزی گرم

2-3-2 - تست اکسیداز

2-3-3 - تست کاتالاز

2-3-4- تست های بیوشیمیایی

2-3-4-1- آزمایش استفـاده از سیـتـرات           

2-3-4-2-آزمایش تحرک و تولید اندول    

2-3-4-3-آزمایش متیل رد (MR

2-3-4-4-آزمایش Voges Proskauer (VP                     

2-3-4-5-آزمایش TSI (  Triple Suger Iron Agar          

2-4 نگهداری سویه ها         

   2-5 تست آنتی بیوگرام

2-5-1 - مواد و وسایل مورد نیاز         

 2-5-2- تست انتی بیوگرام  

2-5-3- روش تهیه 5/ مک فارلند        

2-5-4- طرز تهیه سوسپانسیون باکتریایی معادل غلظت نیم مک فارلند          

2-5-5- روش کار تست حساسیت آنتی بیوتیکی

2-5-6- نحوه تلقیح سوسپانسیون باکتریایی به محیط مولر هینتون آگار

2-6  دیسک های مورد استفاده در این آزمایش                          

2-7- کنترل کیفی دیسک های مورد استفاده                

2-7-1 بررسی تست های حساسیت

2-8- استخراج DNA                       

2-8-1 کـشـت باکـتری ها بر روی محـیط مایع لـوریا برتانی (LB) Louria Bertani

 2-8-2  اسـتـخـراج DNA به روش کیتBIONEER                        

2-8-3- بررسی کمی DNA ژنومیک                 

2-9- واکنش زنجیره پلیمرازی ( ( PCR              

2-9-1-مـواد لازم بـرای PCR

2-9-2 پرایـمرها ی مورد استفاده

2-9-2-1- آماده سازی پرایمرها

2-9-3- اجزای واکنش PCR

2-9-4- آماده سازی مخـلوط اصلی ( Master mix )  برای واکـنـش PCR :

2-9-5-شرایط تکثیرژن Int1 

2-9-6- شرایط تکثیرژن Int2 

2-9-7- شرایط تکثیرژن Int3

2-10- الکتروفورز                

2-10-1  - مواد مورد نیاز برای ساخت ژل آگاروز

2-10-2-تهیه بافر تانک الکتروفورز 

2-10-3- روش تهیه ژل آگاروز 

2-10-4 - عـکسبـرداری از ژل

3-1 - شناسایی و تعین هویت باکتری ها

3-2 - نتایج حساسیت آنتی بیوتیکی

3-2-1 الگو های مقاومت آنتی بیوتیکی

3-3- نتایج  حاصل از بررسی مولکولی کلاس های مختلف اینتگون ها در ایزوله های بالینی تحت بررسی:

3-3-1 فراوانی ژن int 1 در بین ایزوله های مقاوم به آنتی بیوتیک های مختلف :

3-3-2 فراوانی ژن int 2 در بین ایزوله های مقاوم به آنتی بیوتیک های مختلف :

4-1– بحث

 4-2- نتیجه گیری

4-3 – پیشنهادات

 منابع فارسی

منابع لاتین

فهرست جداول

جدول1-1خانواده آنتروباکتریاسه

جدول2-1 غلظت محلول های مختلف جهت تهیه محلول های استاندارد مک فارلند

جدول2-2جدول 2-3 مشخصات مواد در  واکنش 25 میکرولیتری PCR

جدول2-4 شرایط تنظیم دستگاه ترموسیکلر برای ژن های qnrC و qnrS

 جدول2-5 ترکیبات بافر

جدول3-1مشخصات دیسک های آنتی بیوتیکی به همراه قطر هاله

جدول3-2 فراوانی مقاومت اشریشیا کلای نسبت به انتی بیوتیک های کینولونی و فلوئوروکینولون

جدول3-3 فراوانی نسبی ژن های qnrSو qnrC در بین نمونه های مقاوم  به نالدیکسیک اسید

جدول3-4 درصد فراوانی نسبی ژن های qnrSو qnrC در بین نمونه های مقاوم  به سیپروفلوکساسین

جدول 3-5  توزیع ژن های qnrA، qnrB  و qnrS در بین گونه های مختلف باکتریایی

فهرست اشکال

شکل 1-1 ساختمان آنتی بیوتیک های نالیدیکسیک اسید و سیپروفلوکساسین

شکل 3-1: نمایی از تست آنتی بیوگرام

شکل 3-2:  نمایی از ژل آگارز 1 درصد جهت مشاهده محصولات PCR ژن qnrC

شکل 3-3: ژل آگارز 1 درصد