پایان نامه بررسی آزمایشگاهی تأثیرقندحبه ای حاوی استویوساید،ایزومالت وعصاره‌ی متانولی برگ گیاه استویا

پایان نامه کارشناسی ارشد بررسی آزمایشگاهی تأثیر قند حبه ای حاوی استویوساید، ایزومالت و عصاره‌ی متانولی برگ گیاه استویا در تشکیل بیوفیلم استرپتوکوکوس موتانس همراه با فرم پروپوزال مربوطه

چکیده:

زمینه و هدف: پلاک دندان یکی از عوامل اصلی پوسیدگی و تخریب دندان در سطح جهان است و در همه ی اقشار جامعه و همه ی سنین  مشاهده می شود. به دلیل گستردگی پوسیدگی دندان مطالعات زیادی برای حذف و جلوگیری از عوارض آن در سطح دنیا صورت گرفته است. با توجه به اثرات مفید گیاهان دارویی در درمان بیماری های دهانی، عوارض جانبی داروهای شیمیایی و با توجه به افزایش مقاومت به آنتی بیوتیک ها کاربرد داروهای گیاهی رو به افزایش است.

  استویا ریبودیانا برتونی گیاهی از خانواده آستریاسه است که در جنوب آمریکا، پاراگوئه و برزیل رشد می کند. این گیاه دارای بیش از10 گلیکوزید است. استویوساید، ماده شیرین اصلی در برگ های استویا ریبودیانا است که به عنوان یک افزودنی غذایی شیرین و کم کالری مزایای بسیار متنوعی دارد. پایداری، بدون کالری بودن و هم چنین امکان استفاده از آن برای بیماران دیابتی و مبتلایان به فشار خون و چاق از محاسن این ماده به شمار می رود. استویوساید جزء خانواده دی ترپن است که این خانواده دارای خاصیت ضد میکروبی، ضد حساسیت زایی، ضد توموری می باشد. هدف از این تحقیق بررسی اثر عصاره های گیاه استویا و قند حاوی گلیکوزید استویوساید بر روی رشد و تشکیل بیوفیلم باکتری Streptococcus mutans می باشد.

 روش بررسی: سویه باکتریایی Streptococcus mutans از سازمان پژوهش های علمی صنعتی ایران تهیه شد. برگ گیاه استویا خشک و آسیاب گردید و سپس به وسیله¬ی اتانول، متانول در دستگاه سوکسله عصاره گیری شد. همچنین عصاره ی آبی و استونی گیاه استویا به روش خیساندن تهیه گردید. قند حبه ای استویوساید از شرکت اصفهان شکلات تهیه شد. سپس بررسی اثر قند حاوی استویوساید و عصاره های متانولی، اتانولی، آبی و استونی گیاه استویا بر روی رشد  باکتری Streptococcus mutans با روش  میکرودایلوشن و انتشار چاهک و تأثیر این مواد بر روی تشکیل بیوفیلم این باکتری به روش میکرودایلوشن و لامی صورت گرفت.

یافته ها: نتایج نشان دهنده ی اثر مهاری  عصاره¬ی متانولی با mg/ml25=MIC، عصاره ی اتانولی با mg/ml13/3=MIC و عصاره ی استونی با  mg/ml56/1=MIC بر روی رشد و تکثیر Streptococcus mutans بود. عصاره¬ی آبی گیاه استویا، استویوساید و قند حبه ای حاوی استویوساید باعث مهار رشد سویه¬ی مذکور نشد ولی استویوساید و قند حبه ای حاوی استویوساید در مقایسه با ساکارز و قند حبه ای معمولی  باعث مهار تشکیل بیوفیلم Streptococcus mutans گردید.

نتیجه گیری: عصاره¬ی متانولی، اتانولی، استونی برگ گیاه استویا مانع از فعالیت استرپتوکوکوس موتانس می شوند ولی استویوساید و قندحبه¬ای حاوی استویوساید بر روی رشد Streptococcus mutans تأثیری ندارند. همچنین استویوساید و قند حبه ای حاوی استویوساید در تشکیل بیوفیلم استرپتوکوکوس موتانس نقش ندارند.

کلید واژه: استویا ریبودیانا، استویوساید، استرپتوکوکوس موتانس، پوسیدگی دندان، فعالیت ضد میکروبی، عصاره های گیاهی.

 مقدمه:

فصل اول کلیات تحقیق

پلاک دندانی یک اپیدمی خفیف ولی بسیار رایج در سطح جهان است و در همه¬ی اقشار جامعه و همه¬ی سنین  مشاهده می شود (دونلن وکاسترتون ،2002). پلاک دندان یکی ازمهمترین عوامل اصلی ایجاد پوسیدگی دندان است. علاوه بر پوسیدگی در صورت تجمع پلاک بر روی دندان وحذف نشدن آن التهاب از لثه شروع می شود و در اثرپیشرفت بیماری تخریب استخوان آلوئل، سست شدن دندان و در نهایت از دست رفتن دندان ها اتفاق خواهد افتاد. پلاک دندانی نوعی بیوفیلم میکروبی است که در مقایسه با سایر بیوفیلم های میکروبی بیشتر مورد مطالعه قرار گرفته است. در انسان میکروارگانیسم هایی که به عنوان فلور نرمال دهان در نظر گرفته شده اند باعث تشکیل بیوفیلم دندانی می شوند (کانر  وهمکاران،2002).

اجتماعات میکروارگانیسم ها، محصولات خارج سلولی و مواد موجود مابین آن ها بیوفیلم نام دارد.  بیوفیلم را میتوان به عنوان مجموعه ای درنظر گرفت که شامل باکتری هایی متصل به هم و متصل به سطوح است. این مجموعه، ارگانیسم¬های متصل را محافظت می کند. این تعریف شامل تجمع میکروبی فولیکاسیون و جمعیت های متصل به منافذ غشایی هم می شود. بیوفیلم می تواند در شرایط مناسب توسط همه¬ی میکروارگانیسم ها تشکیل شود (ساروک ،2002؛ کاسترتون  وهمکاران، 1995). همچنین بیوفیلم¬ها می¬توانند بر روی سطوح اکوسیستم ها یافت شوند. میکروب ها بسته به فاز رشدشان به 2 گروه پلانکتونیک یا متصل تقسیم می شوند. در مرحله پلانکتونیک میکروارگانیسم ها به صورت ارگانیسم های شناور زندگی می کنند، درحالیکه در فاز متصل به سطوح می چسبند و بیوفیلم تشکیل  می دهند و از لحاظ عملکردی به صورت جامعه ای نزدیک به هم در می آیند (فلتچر ،1991).

تشکیل بیوفیلم یک فرآیند فعال است و شامل اتصال اولیه، تشکیل میکروکلنی، تولید ماده پلیمریک خارج سلولی، به دنبال آن تشکیل بیوفیلم و در نهایت جدا شدن و رهایی سلول ها از بیوفیلم می باشد. مراحل تشکیل بیوفیلم عبارتست از:

 تمایز فنوتیپی و اتصال اولیه : همانند فرآیند های تمایزی در بسیاری از سیستم های دیگر، فرآیند تمایزی که گروه کوچکتری از باکتری های متصل را به یک جمعیت بیوفیلمی احاطه شده در یک ماتریکس بر روی یک سطح تبدیل می کند،  در ابتدا به صورت یک سری از تغییرات مرفولوژیکی دیده می شود. سلول های اتصال یافته¬ی تنها که تشکیل بیوفیلم را بر روی یک سطح به راه می اندازد، در ابتدا فقط توسط میزان کمی از مواد پلی مری احاطه شده اند و بسیاری از آن ها قادر به تحرک و جابه جایی هستند. در این سلول های متصل هنوز فرآیندهای تمایزی که منجر به تشکیل بیوفیلم شود وجود ندارد و ممکن است بسیاری از آن ها از سطح جدا شده و به صورت پلانکتونیک در بیایند. در طول این مرحله از اتصال برگشت پذیر، باکتری ها رفتار های خاص گونه ای از خود نشان می دهند که شامل غلطیدن، خزیدن و تشکیل توده می باشد. این رفتار ها قبل از تولید زیاد پلی ساکارید خارج سلولی و اتصال غیر قابل برگشت صورت می گیرد، همچنین در بسیاری از سلول ها تغییرات فیزیولوژیکی در پاسخ به شرایط خاص محل زندگی جدید صورت  می گیرد، گاهی نیز میکروکلنی های مجزا ممکن است از سطح جدا شده و به حالت پلانکتونیک در آیند.

اتصالات برگشت ناپذیر: از آنجائی که اتصالات برگشت پذیر بر روی چسبیدن باکتری به سطوح اثر       می گذارند، باکتری باید در هنگام رشد به منظور تشکیل یک بیوفیلم بالغ در تماس با سطح باشند. این تغییر از حالت اتصال برگشت پذیر به حالت برگشت ناپذیر توسط زوبل  در سال 1943 به عنوان انتقال از حالت واکنش ضعیف سلول با ماده به یک اتصال دائم به واسطه ی تولید پلیمرهای خارج سلولی مورد توجه قرار گرفت. البته تحقیقات اخیر تغییرات فیزیولوژیکی را مسبب این اتصال می دانند. یکی از مکانیسم های این انتقال پیلی می¬باشد، همچنین تولید پلی ساکاریدهای چسبنده ی بین سلول ها از موارد دیگر در    Staphylococcus epidermitis می باشد که تشکیل میکروکلنی را آسان می کند.

فهرست مطالب:

چکیده    1

فصل اول :کلیات تحقیق

1-1کلیات تحقیق    2

1-2 پرسش اصلی تحقیق     13

1-3 فرضیه های تحقیق       13

1-4 اهداف پژوهش 14

1-5 هدف کاربردی تحقیق     14

1- 6 ضرورت انجام این تحقیق            15

فصل دوم: مروری بر تحقیقات انجام شده

2-1 پلاک دندان     16

2-2 گیاه استویا     16

2-2-1 اثرات ضد سرطانی گیاه استویا  17

2-2-2 خاصیت ضد التهابی وضدحساسیت زایی گیاه استویا           18

2-2-3 اثرات ضد میکروبی گیاه استویا   19

2-2-4 مطالعات صورت گرفته بر روی دام وطیور    19

2-3 استویوساید    20

2-3-1جداسازی و خالص سازی استویوساید      20

2-3-2جذب و متابولیسم استویوساید   21

2-3-3 استویوساید برای درمان بیماری ها          21

2-3-4 اثرات ضد سرطانی استویوساید 22

2-3-5 اثرات ضد میکروبی استویوساید  23

2-4 ایزومالت         23

2-4-1 متابولیسم ایزومالت    24

2-4-2 ایزومالت واثرات آن بر روی پلاک دندان      24

فصل سوم: مواد وروش ها

3-1 دستگاه‌هاي مورد استفاده          26

3-2 مواد مورد استفاده        27

3-3 تهیه عصاره های گیاهی           27

3-4 تهیه ی گلیکوزیدها       28

3-5 تهیه سویه مورد بررسی 28

3-6 بررسی فعالیت ضدمیکروبی         29

3-6-1 بررسی فعالیت ضدمیکروبی با روش انتشار در چاهک           29

3-6-2 تعیین MIC به روش میکرودایلوشن           30

3-7 آزمون تشکیل بیوفیلم     31

3-7-1 آزمون تشکیل بیوفیلم به روش میکرتیترپلیت            31

3-7-2 آزمون تشکیل بیوفیلم به روش لامی         32

فصل چهارم: یافته ها

4-1 نتایج مربوط به اثرات ضدمیکروبی عصاره های آبی،استونی والکلی برگ گیاه استویا  33

4-2 مقایسه تاثیر عصاره های الکلی،استونی و آبی بر روی باکتری  Streptococcus  mutans     .36

4-3 حداقل غلظت مهارکنندگی و حداقل غلظت کشندگی عصاره¬های الکلی برروی باکتری Streptococcus mutans (برحسب میلی گرم برمیلی لیتر)            41

4-4 نتایج مربوط به اثرات ضد میکروبی گلیکوزیدها 41

4-5 نتایج مربوط به اثرگلیکوزیدها برروی تشکیل بیوفیلم  Streptococcus mutans به روش میکرودایلوشن     41

4-6 اثر عصاره¬ی متانولی گیاه استویا بر روی تشکیل بیوفیلم Streptococcus mutans به روش میکرودایلوشن         44

4-7 نتایج مربوط به اثر گلیکوزید ها بر روی تشکیل بیوفیلم streptococcus mutans  به روش لامی44

فصل پنجم: بحث ونتیجه گیری

نتیجه گیری          61

پیشنهادات           61

فهرست منابع       62

فهرست جدول ها

جدول1-1: انواع گلیکوزیدهای برگ گیاه استویا    11

جدول 4-1: میانگین قطر هاله ی عدم رشد در غلظتهای مختلف عصاره¬ی استونی       33

جدول 4-2: میانگین قطر هاله ی عدم رشد در غلظتهای مختلف عصاره¬ی اتانولی        34

جدول 4-3: میانگین قطر هاله ی عدم رشد در غلظتهای مختلف عصاره¬ی متانولی       35

جدول  4-4: حداقل غلظت مهارکنندگی وحداقل غلظت کشندگی عصاره ها    41

جدول 4-5: اثر گلیکوزیدها بر روی تشکیل بیوفیلم Streptococcus mutans به روش میکرودایلوشن42

جدول 4-6: میانگین ODچاهک های میکروتیتر پلیت در روش تشکیل بیوفیلم به روش میکروتیتر پلیت43

فهرست شکل ها

شکل شماره1-1: گیاه استویا            10

شکل شماره 2-1: ساختارشیمیایی ایزومالت     23

شکل شماره4-1: میانگین قطر هاله ی عدم رشد بین عصاره های مختلف در mg/ml50             36

شکل شماره 4-2: میانگین قطر هاله ی عدم رشد بین عصاره های مختلف در  mg/ml25           37

 شکل شماره4-3: میانگین قطر هاله ی عدم رشد بین عصاره های مختلف در mg/ml50/12       38

شکل شماره4-4: میانگین قطر هاله ی عدم رشد بین عصاره های مختلف در mg/ml25/6          39

شکل شماره 4-5: اثر عصاره¬ی استونی بر روی  رشدStreptococus  mutans          40

شکل شماره 4-6: اثر عصاره¬ی اتانولی بر روی  رشد Streptococus mutans            40

شکل شماره 4-7: اثر عصاره¬ی متانولی بر روی  رشد Streptococus  mutans          40

شکل شماره4-8: تشکیل بیوفیلم گلیکوزیدها به روش میکرودایلوشن 42

شکل شماره 4-9: تشکیل بیوفیلم عصاره متانولی به روش میکرودایلوشن       44

شکل شماره 4-10: لام های مربوط به تشکیل بیوفیلم به روش لامی 45

شکل شماره4-11: تصویر میکروسکوپی لام پس از مجاورت بااستویوساید بعد از 48 ساعت          45

شکل شماره4-12: تصویر میکروسکوپی لام پس از مجاورت بااستویوساید بعد از 72 ساعت          .46

شکل شماره4-13: تصویر میکروسکوپی لام پس از مجاورت باایزومالت بعد از 48 ساعت   46

شکل شماره4-14: تصویر میکروسکوپی لام پس از مجاورت باایزومالت بعد از 72 ساعت   47

شکل شماره4-15: تصویر میکروسکوپی لام پس از مجاورت باساکارز بعد از 48 ساعت    47

شکل شماره 4-16: تصویر میکروسکوپی لام پس از مجاورت باساکارز بعد از 72 ساعت   48

شکل شماره4-17: تصویر میکروسکوپی لام پس از مجاورت باقند حبه ای حاوی استویوساید بعد از 48 ساعت           48

شکل شماره 4-18: تصویر میکروسکوپی لام پس از مجاورت باقند حبه ای حاوی استویوساید بعد از 72 ساعت          49

شکل شماره 4-19: تصویر میکروسکوپی لام پس از مجاورت باقند معمولی بعد از 48 ساعت         49

شکل شماره 4-20: تصویر میکروسکوپی لام پس از مجاورت باقند معمولی بعد از 72 ساعت         50