پایان نامه بررسی تغییرات بیان سایتوکاین­ها در موش­های BALB/c واکسینه­­شده با واکسن ژنی pCDNA3.1

توضیحات:

دانلود پروژه و پایان نامه زیست شناسی- ژنتیک - بررسی تغییرات بیان سایتوکاین­ها در موش­های BALB/c واکسینه­­شده با واکسن ژنی pCDNA3.1(-)-flaA به روش real time RT-PCR در 121 صفحه در قالب word و قابل ویرایش همراه با جزئیات کامل

چکیده:

زمینه و هدف: هلیکوباکتر پیلوری شایع ترین باکتری مولد التهاب معده، سرطان و لنفوم معده و زخم های گوارشی در انسان است. ژن flaA یکی از ژن­های ایمنوژن در هلیکوباکتر پیلوری است. این ژن به­­ عنوان یک ایمنوژن برای تحریک سیستم ایمنی میزبان عمل می­­کند. هدف از انجام تحقیق حاضر سنجش بیان سایتوکاین­­هایی نظیر IL4، IL1،IL17  وIFNү  در خون و بررسی بیان ژن flaA در عضله ران موش­های BALB/c واکسینه­­شده با واکسن ژنی pcDNA3.1(-)-flaA به روشreal time RT-PCR  می­باشد.

مواد و روش ها: در این مطالعه تجربی، واکسن ژنی pcDNA3.1(-)-flaA به همراه نانوذرات کیتوزان به موش تزریق شد. سپس سطح بیان سایتوکاین ها در گلبول­های سفید خون و تغییرات بیان ژن flaA در عضله موش مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاصل از واکنش Real time RT-PCR مورد آنالیز آماری قرار گرفت.

یافته­ها: نتایج حاصل نشان دهنده افزایش بیان سایتوکاین IL17 و IFNү   و کاهش IL4 در خون و همچنین بیان موفق ژن flaA در عضله پس از تزریق واکسن بود. بدین صورت که پس از تزریق واکسن درون عضله ی چهار سر ران موش، در طی بازه ی زمانی مورد نظر، افزایش سطح بیان ژن هدف و همچنین تغییر سطح بیان سایتوکاین های خون موش ها حاکی از موثر بودن واکسن است. 

نتیجه گیری: نتایج تحقیق حاضر نشان دهنده­ی ایجاد پاسخ ایمنی موثر علیه واکسن (pCDNA3.1(-)-flaA) در خون موش های واکسینه شده می باشد. همچنین بیان ژن flaA  با گذشت زمان کاهش یافته است.

فهرست مطالب:

چکیده 1

فصل اول «کلیات»       

1-1- تاریخچه‌ی کشف هلیکوباکتر پیلوری 3

   1-2- هلیکوباکتر پیلوری 3

1-3- تاکسونومی و طبقه‌بندی 4

1-4- انواع هلیکوباکتر 5

1-4-1- هلیکوباکتر های معده‌ای 6

1-4-1-1- H.heilmannii (gastrospirillum homonis 6

1-4-1-2- H.felis 7

1-4-1-3- H.acynonix 7

1-4-1-4- H.nemestrinae 7

1-4-2- هلیکوباکتر های روده‌ای 7

  1-4-2-1- H.cinaedi 7

1-4-2-2- H.fennelliae 8

1-4-2-3- H.hepaticus 8

1-4-2-4- H.bilis 8

1-4-2-5- H.pullorum 8

1-5- بیماری‌زایی 8

1-6- روش‌های تشخیص 9

1-6-1- بررسی هیستوپاتولوژی 9

1-6-2- تست اوره آز سریع 9

1-6-3- تست تنفسی اوره (U.B.T 10

1-6-4- سرولوژی 10

 1-6-5- تشخیص مولکولی 11

1-7- درمان 11

1-7-1- آنتی‌بیوتیک‌های مورد مصرف در رژیم ‌درمانی 11

1-7-2- ترکیب دو آنتی‌بیوتیک و یک عامل کمکی (درمان سه‌گانه 12

1-7-3- ترکیب دو آنتی‌بیوتیک و دو عامل کمکی (درمان چهارگانه 12

1-8- اپیدمیولوژی 12

1-9- ساختار ژنوم 13

1-10- ژن flaA 14

1-11- واکسیناسیون 15

1-11-1- تاريخچه واکسن‌ها 15

1-11-2- انواع واکسن‌ها 15

 1-11-2-1- واکسن‌های نسل اول 15

1-11-2-2- واکسن‌های کشته 15

1-11-2-3- واکسن ضعيف شده 16

1-11-2-4- واکسن‌های نسل دوم (واکسن‌های نوترکيب 18

1-11-2-5- واکسن هاي نوترکيب وکتوري 19

1-11-2-6- واکسن هاي آنتي ايديوتيپ 19

1-11-3- روش تهيه واکسن هاي نوترکيب 20

1-11-3-1- خلاصه مراحل توليد پروتئين هاي نوترکيب 20

1-11-3-2- مزاياي واکسن هاي نوترکيب پروتئيني به واکسن هاي متداول 21

1-11-3-3- مشکلات واکسن هاي نوترکيب پروتئيني 21

1-11-4- واکسن هاي نسل سوم يا واکسن هاي ژني 23

1-12- Real time PCR 24

فصل دوم «پیشینه ی تحقیق»

2-1- مروری بر سوابق تحقیق 27

فصل سوم «مواد و روش»

3-1- محل انجام تحقیق 36

3-2- تجهیزات و دستگاه‌های مورد استفاده 36

3-3- مواد مورد استفاده 37

3-4- پلاسمید و باکتری مورد استفاده در این پژوهش  39

3-4-1- پلاسمید pcDNA™3.1  39

3-4-2- باکتری E. coli سویه TOP10F  41

3-5- تکثیر پلاسمید 41

3-5-1- محیط کشتLB-Agar   41

3-5-2- محیط کشت LB-Broth  42

3-5-3- تهیه سلول مستعد  42

3-5-4-  ترانسفورماسیون  43

3-5-5- استخراج پلاسمید 43

3-5-6- سنجش غلظت و خلوص پلاسمید استخراج شده 45

3-6- تهیه بافر TBE 1x 45

3-7- تهیه اتیدیوم بروماید 45

3-8- تهیه ژل آگارز 46

3-9- الکتروفورز 46

3-10- روش تایید صحت استخراج پلاسمید ها 47

3-11- تولید نانوذرات کیتوزان به روش Ionic gelation  47

3-12- تهیه ی محلول های تزریقی به حیوانات آزمایشگاهی 49

3-13- گروه بندی حیوانات آزمایشگاهی و مقادیر و برنامه تزریق واکسن ژنی 50

3-14- نمونه گیری از حیوانات مورد آزمایش 51

3-15- استخراج RNA 52

3-16- رقیق سازی پرایمر ها 54

3-17- سنتز cDNA توسط هگزامرهاي تصادفي 54

3-18- تایید صحت سنتز cDNA 56

3-18- 1- مقدار مواد و واکنش¬گر¬های PCR   56

3-18-2- برنامه زمانی و دمایی برای انجام PCR 57

3-19- انجام Real time RT PCR 57

3-20- روش ΔΔCT 61

3-21- آنالیز آماری 62

فصل چهارم «نتایج»

4-1- نتایج مربوط به ترانسفورماسیون  64

4-2- استخراج پلاسمید  65

4-3- نتایج هضم آنزیمی وکتور pcDNA3.1(-) حاوی ژن flaA 67

4-4- نتایج مربوط به تایید ویژگی های فیزیکوشیمیایی نانوذرات کیتوزان 68

4-5- نتایج مربوط به استخراج RNA 69

4-6- نتایج مربوط به تایید صحت سنتز cDNA 71

4-7- نتایج مربوط به Real time PCR 72

4-8- نتایج مربوط به آنالیز آماری داده ها 77

فصل پنجم «بحث و نتیجه گیری»

5-1- بحث  87

5-2- نتیجه گیری 91

5-3- پیشنهادات 91

منابع 92